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在趨化性細胞遷移后,可通過免疫細胞化學染色研究定向細胞遷移的形態(tài)學特征。ibidi µ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片可對嵌入的HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)進行免疫熒光染色的詳細實驗方案。
µ-Slide 細胞趨化載玻片
一、實驗材料準備:
二、實驗步驟:
將人臍靜脈內皮細胞接種在百分之五十的Matrigel®中,并填充至細胞趨化載玻片中,然后將其沿百分之十的FCS梯度遷移二十四個小時。采用免疫染色法觀察內皮細胞在Matrigel®中定向遷移后的形態(tài)學特征。人臍靜脈內皮細胞的染色是直接在µ-Slide細胞趨化載玻片中進行的。
1) 從一邊儲液池中取出塞子,然后吸出培養(yǎng)基。在抽吸和沖洗步驟中,將塞子留在中央通道中。
2) 用1x PBS洗滌
3) 用百分之四的多聚甲醛固定細胞和基質蛋白
4) 重復實驗操作過程2的步驟
5) 用百分之零點二的riton X-100 / PBS透化細胞
6) 繼續(xù)重復實驗操作過程2的步驟
7) 用百分之一的BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過夜
8) 繼續(xù)重復實驗操作過程2的步驟
9) 添加一抗:單克隆抗VE鈣黏著蛋白,小鼠在四攝氏度下1x 24小時
10) 繼續(xù)重復實驗操作過程2的步驟
11) 添加二抗:山羊抗小鼠IgG,Alexa Fluor 680→在四攝氏度下過夜
12) 繼續(xù)重復實驗操作過程2的步驟
13) 加入染色混合物
i) 羅丹明phalloidin染色肌動蛋白絲
ii) Hoechst 33342對細胞核染色
14) 繼續(xù)重復實驗操作過程2的步驟
15) 將最后的PBS留在儲液罐中并開始成像。
免疫熒光圖像是由共聚焦激光掃描顯微鏡獲得,配以水物鏡。
重要提示:與標準染色方案相比,洗滌和染色步驟所需的培養(yǎng)時間更長。這是為了確保抗體通過凝膠充分擴散。
三、細胞樣品實驗結果:
人臍靜脈內皮細胞在Matrigel®基質中的免疫染色顯示,相鄰的細胞組優(yōu)先形成細胞簇并作為集合體遷移。少數細胞呈單細胞遷移。
圖中顯示人臍靜脈內皮細胞在百分之五十的Matrigel®中的多細胞趨化性的細胞簇。固定后,對細胞進行細胞核藍色、F-肌動蛋白紅色和VE鈣粘蛋白青色等進行染色。白色箭頭表示VE介導的細胞-細胞接觸。
當細胞作為個體遷移時,細胞體被拉長,呈間充質梭形。細胞呈前后極性,前緣呈小片狀,向梯度方向有突起。當以多細胞單元組織時,細胞團簇表現出明顯的前后不對稱的群極化。在這里,一個或幾個前導細胞參與了前緣的形成,前緣表現出細長的突起或寬的片層。遷移復合體較深區(qū)域的連續(xù)細胞沒有極化。然而,這些細胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導的細胞-細胞接觸。